ЧАСТЬ 5. УСЛОВИЯ ДЛЯ ОДОБРЕНИЯ ЦЕНТРОВ СБОРА (УКАЗАННЫХ В СТАТЬЕ 4)

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12

Для того чтобы являться одобренными центрами, центры сбора должны отвечать следующим требованиям:

  1. Они должны находиться под надзором официального ветеринара.
  2. Каждый из центров должен находиться в центре зоны, составляющей не менее 20 км в диаметре, в которой в соответствии с официальными данными не зафиксировано случаев болезни ящура как минимум в течение 30 дней до начала их использования в качестве центров сбора.

III. Перед каждым использованием в качестве одобренных центров сбора, они должны быть очищены и обработаны официально разрешенным в экспортирующей стране дезинфектантом, эффективным для борьбы с болезнью ящура.

  1. Учитывая их возможности по размещению животных они должны иметь:

(a) объект, предназначенный исключительно для использования в качестве центра сбора;

(b) соответствующие помещения, которые легко очищать и дезинфицировать, подходящие для погрузки, разгрузки, и содержащие соответствующие стандартам условия для кормления и поения животных, а также для обеспечения их необходимого лечения;

(c) соответствующие помещения для осуществления инспектирования и изолирования;

(d) соответствующее оборудование для очистки и дезинфекции комнат и грузового транспорта;

(e) соответствующую зону для хранения корма, подстилки и навоза;

(f) соответствующую систему сбора и отведения сточных вод;

(g) кабинет для официального ветеринара.

  1. В период работы в центре сбора должно находиться достаточное количество ветеринаров для выполнения всех обязанностей, перечисленных в Части 5;
  2. Они должны принимать только тех животных, которые имеют индивидуальную идентификацию, в целях обеспечения прослеживаемости. В связи с этим, при поступлении животных в центр сбора собственник или руководитель центра обязан удостовериться, что животные надлежащим образом идентифицированы и сопровождаются ветеринарными документами или сертификатами на соответствующие виды или категории животных.

Также, собственник или руководитель центра сбора обязаны внести в реестр или базу данных для хранения как минимум в течение трех лет имя владельца, информацию о происхождении животных, даты ввоза и вывоза, идентификационный номер животных или регистрационный номер стада происхождения и хозяйство назначения, а также регистрационные номера перевозчика и грузового транспортного средства, доставляющего или забирающего животных из данного центра сбора.

VII. Все животные, проходящие через центр сбора, должны отвечать ветеринарным условиям, установленным для ввоза соответствующей категории животных в Союз.

VIII. Животные, предназначенные для ввоза в Союз и проходящие через центр сбора, в течение шести дней с момента прибытия в центр сбора должны быть погружены и отправлены непосредственно к границе экспортирующей страны:

(a) не контактируя с другими парнокопытными животными, которые не отвечают ветеринарным условиям, установленным для ввоза соответствующей категории животных в Союз;

(b) разделенными на партии таким образом, чтобы ни одна партия не содержала одновременно животных, предназначенных для племенного разведения или производства, вместе с животными, предназначенными для немедленного убоя;

(c) в транспортных средствах или контейнерах, предварительно вычищенных и обработанных с помощью официально разрешенного в экспортирующей стране дезинфектанта, эффективного для борьбы с болезнью ящура, которые сконструированы таким образом, чтобы фекалии, моча, подстилка или корм не вытекали и не выпадали во время транспортировки.

  1. Если условия экспорта животных в Союз требуют проведения тестирования в течение определенного периода перед погрузкой, этот период должен включать любой период сбора, вплоть до шести дней от даты прибытия животных в одобренный центр сбора.
  2. Экспортирующая третья страна обязана назначить центры сбора для животных, предназначенных для разведения и производства, а также центры для животных, предназначенных для убоя, и должна уведомлять Европейскую Комиссию и компетентные центральные органы государств-членов ЕС о названиях и адресах этих объектов. Данная информация должна регулярно обновляться.
  3. Экспортирующая третья страна должна определить процедуру официального надзора за одобренными центрами сбора и обеспечить осуществление данного надзора.

XII. Одобренные центры сбора должны регулярно инспектироваться компетентными органами власти третьей страны с целью проверки выполнения требований для одобрения центра, установленных в пунктах I — XI.

Если такие проверки выявят, что установленные условия более не выполняются, разрешение действия центра должно быть приостановлено. Разрешение может быть возобновлено, только если компетентный орган третьей страны установит, что центр полностью соответствует всем условиям, установленным в пунктах I — XI.

 

ЧАСТЬ 6. ПРОТОКОЛЫ СТАНДАРТИЗАЦИИ МАТЕРИАЛОВ И ПРОЦЕДУРЫ ТЕСТИРОВАНИЯ (УКАЗАННЫЕ В СТАТЬЕ 5)

 

ТУБЕРКУЛЕЗ (TBL)

 

Единичная внутрикожная туберкулиновая проба с использованием туберкулина КРС должна быть выполнена в соответствии с Приложением B к Директиве 64/432/ЕЭС. В случае животных семейства свиных (Suidae) единичная внутрикожная туберкулиновая проба с использованием туберкулина птиц должна быть выполнена в соответствии с Приложением B к Директиве 64/432/ЕЭС, за исключением того, что инъекцию вводят в рыхлую кожу в основании уха.

 

БРУЦЕЛЛЕЗ (BRUCELLA ABORTUS) (BRL)

 

Реакция сывороточной агглютинации, реакция фиксации комплемента, тест с забуференным антигеном Brucella, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) должны проводиться в соответствии с Приложением C к Директиве 64/432/ЕЭС.

 

БРУЦЕЛЛЕЗ (BRUCELLA MELITENSIS) (BRL)

 

Тесты должны проводиться в соответствии с Приложением C к Директиве 91/68/ЕЭС.

 

ЭНЗООТИЧЕСКИЙ ЛЕЙКОЗ КРС (EBL)

 

Реакция иммунодиффузии в агаровом геле и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) должны проводиться в соответствии с параграфами A и C Главы II Приложения D к Директиве 64/432/ЕЭС.

 

БЛУТАНГ (BTG)

 

  1. Блокирующий или конкурентный анализ ELISA должен проводиться в соответствии со следующим протоколом:

Конкурирующий ELISA с использованием моноклонального антитела 3-17-A3 может идентифицировать антитела ко всем известным серотипам вируса блутанга.

Принцип теста заключается в прерывании реакции между антигеном вируса блутанга и группоспецифическим моноклональным антителом (3-17-A3) при добавлении тест-сыворотки. Антитела к вирусу блутанга, присутствующие в тест-сыворотке, блокируют реактивность моноклонального антитела (Мат) и приводят к снижению предполагаемого цветного проявления после добавления меченного ферментом антимышиного антитела и хромогена/субстрата. Для получения конечной точки разведения сыворотку можно тестировать при однократном разведении 1:5 (капельный тест — Приложение 1) или можно титровать (титрация сыворотки — Приложение 2). Значения ингибирования, превышающие 50%, могут считаться положительными.

Материалы и реактивы

  1. Соответствующие титрационные микропланшеты для ELISA
  2. Антиген: поставляется в виде экстрагированного из клеток концентрата, приготовленного согласно нижеприведенному описанию, и хранится либо при температуре — 20 °C, либо при — 70 °C.
  3. Блокирующий буфер: фосфатно-буферный солевой раствор (ФБР), содержащий 0,3% отрицательной к блутангу сыворотки взрослого КРС, 0,1% (объем/объем) Tween-20 (поставляется в виде полиоксиэтиленсорбитана монолаурата) в ФБР.
  4. Моноклональное антитело: 3-17-A3 (поставляется в виде надосадочной жидкости культуры клеток гибридомы), направлено непосредственно против группо-специфического полипептида VP7, хранится при температуре — 20 °C или в лиофилизированном виде, и перед использованием разводится 1/100 блокирующим буфером.
  5. Конъюгат: кроличий антимышиный глобулин (адсорбированный и элюированный), конъюгированный пероксидазой из хрена, хранится в темном месте при температуре 4 °C.
  6. Хромоген и субстрат: Ортофенилендиамин (OPD-хромоген) в конечной концентрации 0,4 мг/мл в стерильной дистиллированной воде. Перекись водорода (субстрат 30% вес/объем) 0,05% объем/объем добавленный непосредственно перед использованием (5 мкл H2O2 на 10 мл OPD). (Работать с OPD аккуратно — использовать резиновые перчатки — возможный мутаген).
  7. 1-молярная серная кислота: 26,6 мл кислоты добавляют к 473,4 мл дистиллированной воды (Помните: кислоту следует добавлять в воду, но никогда не добавлять воду в кислоту).
  8. Орбитальный встряхиватель
  9. Планшет-ридер для ELISA (тест возможно считывать визуально).

Формат теста

Cc: контроль конъюгата (без сыворотки/без моноклонального антитела), C++: сильный положительный сывороточный контроль; C+: слабый положительный сывороточный контроль; C-: отрицательный сывороточный контроль; Cm: контроль моноклонального антитела (без сыворотки).

Дополнение 1:

Формат капельного разведения (1:5) (40 сывороток/планшет)

Контроль Тест-сыворотка
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
C C++ C++
D C++ C++
E C+ C+
F C+ C+
G Cm Cm 40
H Cm Cm 40

Дополнение 2:

Формат титрации сывороток (10 сывороток/планшет)

Контроль Тест-сыворотка
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Cc C- 1:5 1:5
B Cc C- 1:10 1:10
C C++ C++ 1:20 1:20
D C++ C++ 1:40 1:40
E C+ C+ 1:80 1:80
F C+ C+ 1:160 1:160
G Cm Cm 1:320 1:320
H Cm Cm 1:640 1:640

Протокол тестирования:

Контроль конъюгата (Cc): Лунки 1A и 1B — это холостая контрольная проба, состоящая из антигена к вирусу блутанга и конъюгата. Она может использоваться для сброса показателей ридера ELISA.

Контроль Мат (Cm): Колонки 1 и 2, ряды G и H — контроль моноклональных антител, содержат антиген к вирусу блутанга, моноклональное антитело и конъюгат. Эти лунки представляют самый выраженный цвет. Среднее значение показателей оптической плотности данного контроля составляет 0% показателя ингибирования.

Положительный контроль (C++, C+): Колонки 1 и 2, ряды C-D-E-F. Эти лунки содержат антиген к вирусу блутанга, сильноположительную и слабоположительную антисыворотку соответственно, Мат и конъюгат.

Отрицательный контроль (C-): Лунки 2A и 2B — отрицательные контроли, которые содержат антиген к вирусу блутанга, сыворотку, отрицательную к вирусу блутанга, Мат и конъюгат.

Исследуемые сыворотки: В ходе крупномасштабных серологических исследований и для быстрого скрининга сыворотки можно исследовать при однократном разведении 1:5 (Приложение 1). И, наоборот, 10 сывороток можно исследовать в диапазоне разведения от 1:5 до 1:640 (Приложение 2). Это обеспечит некоторое указание на титр антител в исследуемых сыворотках.

Процедура:

  1. Развести антиген вируса блутанга в ФБР до дотитрационной концентрации, провести кратковременную обработку ультразвуком для рассеивания скопившегося вируса (при отсутствии ультразвукового аппарата энергично перемешать с помощью пипетки) и добавить 50 мкл во все лунки планшета ELISA. Постучать по сторонам планшета, чтобы распределить антиген.
  2. Инкубировать при температуре 37 °C в течение 60 минут на орбитальном встряхивателе. Трижды промыть планшеты, наливая в лунки и выливая из них нестерильный ФБР и просушить впитывающей бумагой.
  3. Контрольные лунки: Добавить 100 мкл блокирующего буфера в лунки Cc. Добавить 50 мкл положительных и отрицательных контрольных сывороток в разведении 1:5 (10 мкл сывороток + 40 мкл блокирующего буфера) в соответствующие лунки C-, C+ и C++. Добавить 50 мкл блокирующего буфера в контрольные лунки с Мат.

Метод капельного титрования: Добавить разведение каждой исследуемой сыворотки 1:5 в блокирующий буфер для удвоения лунок в рядах 3 — 12 (10 мкл сыворотки + 40 мкл блокирующего буфера),

или

Метод титрования сывороток: Подготовить серии двукратного разведения каждого испытуемого образца (от 1:5 до 1:640) в блокирующем буфере по восьми лункам одиночных рядов 3 — 12.

  1. Сразу после добавления тестируемых сывороток развести Мат 1:100 в блокирующем буфере и добавить 50 мкл во все лунки планшета, кроме лунок холостого контроля.
  2. Инкубировать при температуре 37 °C в течение 60 минут на орбитальном встряхивателе. Трижды промыть в ФБР и промокнуть насухо.
  3. Развести кроличий антимышиный концентрат до 1/5 000 в блокирующем буфере и добавить 50 мкл во все лунки планшета.
  4. Инкубировать при температуре 37 °C в течение 60 минут на орбитальном встряхивателе. Трижды промыть в ФБР и промокнуть насухо.
  5. Разморозить O-фенилендиамина дигидрохлорид (OPD) и непосредственно перед использованием добавить 5 мкл 30% перекиси водорода в каждые 10 мл OPD. Добавить 50 мкл во все лунки планшета. Подождать около 10 минут до образования цвета и остановить реакцию 1-молярной серной кислотой (50 мкл на лунку). Цвет должен проявиться в контрольных лунках с Мат, а также в лунках с сыворотками без антител к вирусу блутанга.
  6. Изучить и зарегистрировать данные с планшетов визуально либо с использованием спектрофотометрического ридера.

Анализ результатов:

Используя программное обеспечение, распечатать значения оптической плотности (OD) и процент ингибирования (PI) для исследуемых и контрольных сывороток на основании среднего значения, полученного для контрольных лунок с антигеном. Данные, выраженные как OP и PI, используются для определения того, проведен ли тест в рамках допустимых пределов. Верхний допустимый предел (UCL) и нижний допустимый предел (LCL) для контроля Мат (антиген плюс Мат в отсутствие исследуемых сывороток) находится в диапазоне значений OD от 0,4 до 1,4. Любой планшет, который не соответствует вышеуказанным критериям, должен быть отбракован.

Если отсутствует программное обеспечение, распечатать значение OD с использованием принтера ELISA. Рассчитать среднее значение OD для контрольных лунок с антигеном, которое эквивалентно 100% значению. Определить 50% значения OD и вручную рассчитать положительность и отрицательность каждого образца.

Процентное значение ингибирования (PI) = 100 — (OD каждого тестового образца / Средняя OD Cm) x 100.

Дублирующие лунки с отрицательной контрольной сывороткой и дублирующие лунки с холостым контролем должны показать значения PI в диапазоне от + 25% и — 25%, а также в диапазоне от + 95% до + 105%, соответственно. Превышение от этих пределов не говорит о необходимости выбраковки планшета, но предполагает развитие фонового цвета. Сильные и слабые положительные контрольные сыворотки должны показывать значения PI в диапазоне от + 81% до + 100% и в диапазоне от + 51% до + 80%, соответственно.

Диагностические пороговые значения для испытуемых сывороток составляют 50% (PI 50% или OD 50%). Образцы, проявляющие значения OD > 50% регистрируются как отрицательные. Образцы, которые показывают значения PI выше и ниже пороговых значений для дублирующих лунок, считаются сомнительными; данные образцы следует тестировать повторно при помощи капельного теста и/или титрования. Положительные образцы можно также титровать для получения указания на степень положительности.

Визуальное считывание: Положительные и отрицательные образцы можно легко определить невооруженным глазом; слабоположительные и сильно отрицательные образцы определить на глаз сложнее.

Приготовление антигена вируса блутанга для ELISA:

  1. Отмыть 40 — 60 матрасов Ру сливающихся клеток ВНК-21 три раза свободной от сыворотки средой Игла и инфицировать вирусом блутанга серотипа 1 в свободной от сыворотки среде Игла.
  2. Инкубировать при температуре 37 °C и ежедневно изучать цитопатогенное действие (ЦПД).
  3. Когда ЦПД завершено на 90 — 100% клеточного покрова каждого матраса Ру, собрать вирус, стряхнув все еще прикрепленные клетки со стекла.
  4. Центрифугировать при 2000 — 3000 об/мин для осаждения клеток.
  5. Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в около 30 мл ФБР, содержащем 1% саркозила и 2 мл фенилметилсульфонилфторида (лизирующего буфера). Это может вызвать образование геля из клеток, и для снижения этого эффекта необходимо добавить лизирующий буфер (NB: Фенилметилсульфонилфторид опасен — использовать с чрезвычайной осторожностью).
  6. Разрушать клетки в течение 60 секунд с использованием ультразвукового зонда с амплитудой 30 микрон.
  7. Центрифугировать 10 минут при 10 000 об/мин.
  8. Хранить надосадочную жидкость при температуре + 4 °C и ресуспендировать оставшийся осадок клеток в 10 — 20 мл лизирующего буфера.
  9. Разрушать ультразвуком и очищать, сохраняя на каждом этапе надосадочную жидкость, всего три раза.
  10. Собрать и объединить надосадочную жидкость и центрифугировать при 24 000 об/мин (100.000 г) в течение 120 минут при температуре + 4 °C над 5 мл слоем 40% сахарозы (вес/объем в ФБР), используя 30 мл пробирки Бекмана для центрифугирования и ротор 28 SW.
  11. Удалить надосадочную жидкость, тщательно высушить пробирки и ресуспендировать осадок ФБР посредством обработки ультразвуком. Хранить антиген в аликвотах при температуре — 20 °C.

Титрование антигена вируса блутанга для ELISA:

Антиген блутанга для ELISA титруют посредством непрямого ELISA. Двукратное разведение антигена титруют по отношению к постоянному разведению (1/100) моноклонального антитела 3-17-A3. Протокол следующий:

  1. Титровать разведение 1:20 антигена вируса блутанга в ФБР на титрационном микропланшете сериями двукратных разведений (50 мкл/лунка), используя многоканальную пипетку.
  2. Инкубировать в течение часа при температуре 37 °C на орбитальном встряхивателе.
  3. Трижды промывать планшеты ФБР.
  4. Добавить 50 мкл моноклонального антитела 3-17-A3 (разведенного 1/100) в каждую лунку титрационного микропланшета.
  5. Инкубировать в течение часа при температуре 37 °C на орбитальном встряхивателе.
  6. Трижды промывать планшеты ФБР.
  7. Добавить 50 мкл кроличьего антимышиного глобулина, конъюгированного с пероксидазой из хрена, разведенного до дотитрационной оптимальной концентрации, в каждую лунку титрационного микропланшета.
  8. Инкубировать в течение часа при температуре 37 °C на орбитальном встряхивателе.
  9. Добавить субстрат и хромоген, как описано выше. Через 10 минут остановить реакцию, добавив 1-молярную серную кислоту (50 мкл/лунка).

При проведении конкурентного анализа моноклональные антитела должны быть в избытке, следовательно, выбирается такое разведение антигена, находящееся в пределах титрационной кривой (не на участке плато), которое через 10 минут обеспечивает приблизительно 0,8 OD.

  1. Реакция иммунодиффузии в агаровом геле проводится в соответствии со следующим протоколом:

Антиген:

Преципитирующий антиген подготавливается в любой культуре клеток, которая способствует быстрому увеличению эталонного штамма вируса блутанга. Рекомендуются клетки ВНК или Vero. Антиген присутствует в надосадочной жидкости в конце роста вируса, но для того, чтобы он был эффективен, необходима 50 — 100-кратная концентрация. Это может быть достигнуто при использовании любой стандартной процедуры повышения концентрации белка; вирус в антигене может быть инактивирован посредством добавления 0,3% (объем/объем) бета-пропиолактона.

Известные положительные контрольные сыворотки:

Используя международные эталонные сыворотки и антиген, получают национальную стандартную сыворотку, стандартизированную для оптимальной пропорции к международной эталонной сыворотке, высушивают сублимацией и используют в качестве контрольной сыворотки в каждом тесте.

Исследуемая сыворотка

Процедура:

1% агарозу, приготовленную в соли борной кислоты или натрий-барбиталовом буфере, pH 8,5 — 9,0, налить в чашку Петри слоем минимум 3,0 мм. Тест-паттерн из семи свободных от влаги лунок диаметром 5,0 мм каждая вырезается в агаре. Паттерн состоит из одной центральной лунки и шести лунок, расположенных в виде круга радиусом 3 см. Центральную лунку наполнить стандартным антигеном. Периферийные лунки 2, 4 и 6 наполнить известной положительной сывороткой, лунки 1, 3 и 5 наполнить исследуемой сывороткой. Систему инкубируют до 72 часов при комнатной температуре в закрытой влажной камере.

Интерпретация:

Исследуемая сыворотка считается положительной, если она образует специфичную линию преципитации с антигеном и образует полную линию тождественности с контрольной сывороткой. Испытуемая сыворотка считается отрицательной, если она не образует специфичной линии преципитации с антигеном и не искажает линию контрольной сыворотки. Чашки Петри следует изучать на темном фоне, используя непрямое освещение.

 

ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКАЯ БОЛЕЗНЬ (EHD)

 

Реакция иммунодиффузии в агаровом геле проводится в соответствии со следующим протоколом:

Антиген:

Преципитирующий антиген подготавливается в любой культуре клеток, которая способствует быстрому увеличению соответствующего серотипа(-ов) вируса эпизоотической геморрагической болезни. Рекомендуются клетки ВНК или Vero. Антиген присутствует в надосадочной жидкости в конце роста вируса, но для того, чтобы он был эффективен, необходима 50 — 100-кратная концентрация. Это может быть достигнуто при использовании любой стандартной процедуры увеличения концентрации белка; вирус в антигене может быть инактивирован посредством добавления 0,3% (объем/объем) бета пропиолактона.

Известные положительные контрольные сыворотки:

Используя международные эталонные сыворотку и антиген, получают национальную стандартную сыворотку, стандартизированную для оптимальной пропорции к международной эталонной сыворотке, высушивают сублимацией и используют в качестве контрольной сыворотки в каждом тесте.

Исследуемая сыворотка

Процедура: 1% агарозу, приготовленную в соли борной кислоты или натрий-барбиталовом буфере, pH 8,5 — 9,0, налить в чашку Петри слоем минимум 3,0 мм. Тест-паттерн из семи свободных от влаги лунок диаметром 5,0 мм каждая вырезается в агаре. Паттерн состоит из одной центральной лунки и шести лунок, расположенных в виде круга радиусом 3 см. Центральную лунку наполнить стандартным антигеном. Периферийные лунки 2, 4 и 6 наполнить известной положительной сывороткой, лунки 1, 3 и 5 наполнить исследуемой сывороткой. Систему инкубируют до 72 часов при комнатной температуре в закрытой влажной камере.

Интерпретация: Исследуемая сыворотка считается положительной, если она образует специфичную линию преципитации с антигеном и образует полную линию тождественности с контрольной сывороткой. Испытуемая сыворотка считается отрицательной, если она не образует специфичной линии преципитации с антигеном и не искажает линию контрольной сыворотки. Чашки Петри следует изучать на темном фоне, используя непрямое освещение.

 

ИНФЕКЦИОННЫЙ РИНОТРАХЕИТ КРС (IBR)/ ИНФЕКЦИОННЫЙ ПУСТУЛЕЗНЫЙ ВУЛЬВОВАГИНИТ (IPV)

 

  1. Реакцию сывороточной нейтрализации следует проводить в соответствии со следующим протоколом:

Сыворотка: Перед использованием все сыворотки термоинактивируются в течение 30 минут при температуре 56 °C.

Процедура: При проведении реакции сывороточной нейтрализации с постоянно меняющимся вирусом на титрационных микропланшетах используют клетки MDBK или другие чувствительные клетки. Colorado, Oxford, или любой другой эталонный штамм вируса используется в дозе 100 ТЦД50 на 0,025 мл; образцы инактивированной неразведенной сыворотки смешать с равным объемом (0,025 мл) суспензии вируса. Смеси вируса и сыворотки инкубировать в течение 24 часов при температуре 37 °C на титрационных микропланшетах перед добавлением клеток MDBK. Клетки использовать в такой концентрации, которая образует полный монослой через 24 часа.

Контроли: (i) анализ инфективности вируса, (ii) контроль токсичности сыворотки, (iii) контроль неинокулированной культуры клеток, (iv) эталонная антисыворотка.

Интерпретация: Результаты реакции нейтрализации и титр вируса, используемого в тесте, регистрируются через три — шесть дней инкубации при температуре 37 °C. Титры сыворотки считаются отрицательными, если при разведении 1/2 (неразведенная сыворотка) отсутствует нейтрализация.

  1. Любой другой тест, признанный в рамках Решения 2004/558/ЕС <*>

———————————

<*> ОЖ N L 249, 23.7.2004, стр. 20.

 

ЯЩУР (FMD)

 

  1. Отбор образцов из пищевода/глотки и тестирование следует проводить в соответствии со следующим протоколом:

Реагенты: Перед отбором образцов подготовить транспортную среду. По 2 мл залить в количество контейнеров, соответствующее количеству животных, от которых будут забираться образцы. Используемые контейнеры должны быть устойчивы к замораживанию твердой CO2 или жидким азотом. Образцы получают при использовании специального коллектора слюны или гибкого зонда. Для получения образца пробоотборник гибкого зонда пропустить через рот, через спинку языка и вниз в верхнюю часть пищевода. Попытаться сделать соскреб с покровного эпителия верхней части пищевода и глотки посредством движений вбок и вверх. Затем зонд вынуть, по возможности, после того как животное сглотнет. Пробоотборник должен быть полным и должен содержать смесь слизистой, слюны, глоточной жидкости и омертвевшие клетки. Необходимо убедиться, что каждый образец содержит один видимый клеточный материал. Следует избегать грубого обращения, которое может вызвать кровотечение.

Образцы от некоторых животных могут быть сильно контаминированы содержимым рубца. Такие образцы должны быть отбракованы, а перед повторным отбором образцов рот животного необходимо сполоснуть водой или, предпочтительно, физиологическим раствором.

Обработка образцов: Каждый образец, отобранный пробоотборником, исследовать на качество и 2 мл добавить в равный объем транспортной среды в контейнер, который устойчив к замораживанию. Контейнеры плотно закрыть, герметизировать, продезинфицировать и промаркировать. Образцы хранить в прохладном месте (+ 4 °C) и исследовать в течение трех — четырех часов или поместить на сухой лед (- 69 °C) или в жидкий азот и хранить в замороженном виде до момента исследования. Между отбором образцов от разных животных пробоотборник дезинфицировать и промыть в трех сменах чистой воды.

Тестирование на вирус ящура: Образцы инокулировать в первичные культуры клеток бычьей щитовидной железы, используя минимум три пробирки на один образец. Можно использовать другие чувствительные клетки, такие как первичные клетки бычьей или свиной почки, но следует помнить, что в отношении некоторых штаммов вируса ящура они менее чувствительны. Пробирки инкубировать при температуре 37 °C на аппарате для вращающихся колб и ежедневно в течение 48 часов исследовать на наличие цитопатического эффекта (ЦПЭ). Если реакция отрицательная, провести слепой пассаж культур в новые культуры и повторно исследовать в течение 48 часов. Специфичность любого ЦПЭ необходимо подтверждать.

Рекомендуемая транспортная среда:

  1. 0,08 М фосфатного буфера, pH 7,2, содержащего 0,01% альбумина бычьей сыворотки, 0,002% фенолового красного и антибиотики.
  2. Тканевую культуральную среду (такую как минимальная поддерживающая среда Игла), содержащую 0,04 М Hepes буфера, 0,01% альбумина бычьей сыворотки и антибиотики, pH 7,2.
  3. Антибиотики (на мл конечного продукта) необходимо добавлять в транспортную среду, например, пенициллин 1000 МЕ, неомицина сульфат 100 МЕ, полимиксин B сульфат 50 МЕ, микостатин 100 МЕ.
  4. Реакция нейтрализации вируса должна проводиться в соответствии со следующим протоколом:

Реагенты: Исходный антиген вируса ящура получают в культуре клеток или в языках КРС и хранят при температуре — 70 °C или ниже или при — 20 °C после добавления 50% глицерина. Это исходный антиген. Вирус ящура устойчив при этих условиях и титры мало меняются в течение нескольких месяцев.

Процедура: Тест проводится на градуированных титрационных микропланшетах для культивирования тканей с плоским дном с использованием чувствительных клеток, таких как IB-RS-2, BHK-21 или клеток почки теленка. Сыворотку для теста развести в соотношении 1/4 в свободной от сыворотки культуральной среде с добавлением 100 МЕ/мл неомицина или других подходящих антибиотиков. Сыворотки инактивировать при температуре 56 °C в течение 30 минут, и объемы 0,05 мл использовать для подготовки двукратных разведений на титрационных микропланшетах с использованием циклов разведения 0,05 мл. Предварительно титрованный вирус также развести в свободной от сыворотки культуральной среде, содержащей 100 ТЦД50/0,05 мл, и затем добавить в каждую лунку. После инкубирования при температуре 37 °C в течение одного часа для обеспечения нейтрализации 0,05 мл суспензионных клеток, содержащих 0,5 — 1,0 x 106 клеток на 1 мл, в среде для выращивания клеток, содержащей сыворотку, свободную от антител к вирусу ящура, добавить в каждую лунку и планшеты герметично закрыть. Планшеты инкубировать при температуре 37 °C. Монослои обычно сливаются в течение 24 часов. Через 48 часов ЦПЭ обычно достаточно выражен, чтобы можно было считать результаты теста через микроскоп. В это время можно провести итоговое считывание результатов посредством микроскопии или планшеты можно зафиксировать и провести окрашивание для считывания макроскопическими методами, например, с использованием 10% формолсолевого раствора или 0,05% метиленового синего.

Контроль: При каждом тесте контроль включает гомологичные антисыворотки с известным титром, клеточный контроль, контроль токсичности сыворотки, контроль среды и титрацию вируса, от которой рассчитывается фактическое количество вируса в тесте.

Интерпретация: Лунки с признаками ЦПЭ считаются инфицированными, и титры нейтрализации выражаются в виде значения, обратного конечному разведению сыворотки, присутствующей в смесях сыворотки и вируса при 50% конечной точке, определенной по методу Спирмена Кербера (Karber, G., 1931 Archiv fuer Experimentelle Pathologie und Pharmokologie, 162, 480.). Тесты считаются действительными, если фактическое количество вируса, используемого на одну лунку в ходе теста, составляет от 101,5 до 102,5 ТЦД50 и если титр эталонной сыворотки находится в диапазоне двукратного значения предполагаемого титра, определенного на основании предыдущих титрований. Если контроль выходит за пределы этих значений, тесты следует повторить. В конечной точке титр 1/11 и меньше считается отрицательным.

  1. Выявление и определение количества антител посредством ELISA следует проводить в соответствии со следующим протоколом:

Реагенты: Кроличья антисыворотка к антигену 146S семи типов вируса ящура используется в предварительно определенной оптимальной концентрации в карбонатном/бикарбонатном буфере, pH 9,6. Антигены готовят из отобранных штаммов вируса, выращенного на монослоях клеток ВНК-21. Используют неочищенные надосадочные жидкости и их предварительно титруют в соответствии с протоколом, но без сыворотки, для получения разведения, которое после добавления равного объема ФБР (фосфатно-буферного солевого раствора, содержащего 0,05% Tween-20 и индикатор в виде фенолового красного) обеспечит показатели оптимальной плотности в диапазоне от 1,2 до 1,5. Вирусы можно использовать в инактивированном состоянии. ФБР можно использовать в качестве разбавителя. Антисыворотку морской свинки получают посредством введения морским свинкам антигена 146S каждого серотипа. Предварительно определенную оптимальную концентрацию готовят в ФБР, содержащем 10% нормальной бычьей сыворотки и 5% нормальной кроличьей сыворотки. Кроличий иммуноглобулин против морской свинки, конъюгированный с пероксидазой из хрена, используется в предварительно определенной оптимальной концентрации в ФБР, содержащем 10% нормальной бычьей сыворотки и 5% нормальной кроличьей сыворотки. Испытуемые сыворотки разводят в ФБР.

Процедура:

  1. Планшеты ELISA покрыть 50 мкл кроличьих антивирусных сывороток в течение ночи во влажной камере при комнатной температуре.
  2. Пятьдесят микролитров сдвоенных, двукратных серий каждой исследуемой сыворотки, начиная с 1/4, приготовить на многолуночных планшетах с U-образным дном (планшет-носитель). Пятьдесят микролитров постоянной дозы антигена добавить в каждую лунку и смеси оставить на ночь при температуре 4 °C. Добавление антигена сокращает исходное разведение сыворотки до 1/8.
  3. Планшеты ELISA отмывать пять раз ФБР.
  4. Затем пятьдесят микролитров смеси сыворотки и антигена перенести с планшетов-носителей на ELISA-планшеты, сенсибилизированные кроличьей сывороткой, и инкубировать в течение часа при температуре 37 °C на ротационном встряхивателе.
  5. После отмывки 50 мкл антисыворотки морской свинки к антигену, используемой в точке 4, добавить в каждую лунку. Планшеты инкубировать в течение часа при температуре 37 °C на ротационном встряхивателе.
  6. Планшеты отмыть и добавить в каждую лунку 50 мкл кроличьего иммуноглобулина против IgG (H + L) морской свинки, конъюгированного с пероксидазой из хрена. Планшеты инкубировать в течение часа при температуре 37 °C на ротационном встряхивателе.
  7. Планшеты отмыть и в каждую лунку добавить 50 мкл ортофенилендиамина, содержащего 0,05% H2O2 (30%) вес/объем.
  8. Через 15 минут реакцию остановить посредством 1,25 М H2SO4.

Планшеты считывать спектрофотометрическим способом при 492 нм на ридере ELISA, подсоединенном к микрокомпьютеру.

Контроль: Для каждого антигена используются 40 лунок сыворотки, не содержащих сыворотки, но содержащих антиген, разведенный в ФБР. Дублированные серии двукратных разведений гомологичной бычьей эталонной антисыворотки. Дублированные серии двукратных разведений отрицательной бычьей сыворотки.

Интерпретация: Титры антител выражают в виде конечного разведения испытуемой сыворотки, составляющего 50% среднего значения OD, зарегистрированного в лунках с контрольным вирусом, где отсутствует исследуемая сыворотка. Титры, превышающие 1/40, считаются положительными.

Библиография: Hamblin C, Barnett ITR and Hedger RS (1986) «A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA». Journal of Immunological Methods, 93, 115 to 121.11.

 

БОЛЕЗНЬ АУЕСКИ (AJD)

 

  1. Реакцию сывороточной нейтрализации следует проводить в соответствии со следующим протоколом:

Сыворотка: Перед использованием все сыворотки термоинактивируются в течение 30 минут при температуре 56 °C.

Процедура: При проведении реакции сывороточной нейтрализации с постоянно меняющимся вирусом на титрационных микропланшетах используют клетки Vero или другие чувствительные клетки. Вирус болезни Ауески используется в дозе 100 ТЦД50 на 0,025 мл; образцы инактивированной неразведенной сыворотки смешать с равным объемом (0,025 мл) суспензии вируса. Смеси вируса и сыворотки инкубировать в течение 2 часов при температуре 37 °C на титрационных микропланшетах перед добавлением соответствующих клеток. Клетки использовать в такой концентрации, которая образует полный монослой через 24 часа.

Контроль: (i) анализ инфективности вируса, (ii) контроль токсичности сыворотки, (iii) контроль неинокулированной культуры клеток, (iv) эталонная антисыворотка.

Интерпретация: Результаты реакции нейтрализации и титр вируса, используемого в тесте, регистрируются через три — семь дней инкубирования при температуре 37 °C. Титры сыворотки меньше 1/2 (неразведенная сыворотка) считаются отрицательными.

  1. Любой другой тест, признанный в рамках Решения 2008/185/ЕС <*>.

———————————

<*> ОЖ N L 59, 4.3.2008, стр. 19.

 

ТРАНСМИССИВНЫЙ ГАСТРОЭНТЕРИТ (TGE)

 

Реакцию сывороточной нейтрализации следует проводить в соответствии со следующим протоколом:

Сыворотка: Перед использованием все сыворотки термоинактивируют в течение 30 минут при температуре 56 °C.

Процедура: При проведении реакции сывороточной нейтрализации с постоянно меняющимся вирусом на титрационных микропланшетах используют клетки A72 (опухоль собаки) или другие чувствительные системы клеток. Вирус TGE используется в дозе 100 ТЦД50 на 0,025 мл; образцы инактивированной неразведенной сыворотки смешать с равным объемом (0,025 мл) суспензии вируса. Смеси вируса и сыворотки инкубировать в течение 30 — 60 минут при температуре 37 °C на титрационных микропланшетах перед добавлением соответствующих клеток. Клетки использовать в такой концентрации, которая образует полный монослой через 24 часа. Каждая клетка получает 0,1 мл суспензии клеток.

Контроль: (i) анализ инфективности вируса, (ii) контроль токсичности сыворотки, (iii) контроль неинокулированной культуры клеток, (iv) эталонная антисыворотка.

Интерпретация: Результаты реакции нейтрализации и титр вируса, используемого в тесте, регистрируются через три — пять дней инкубирования при температуре 37 °C. Титры сыворотки меньше 1/2 (конечное разведение) считаются отрицательными. Если неразведенные образцы сывороток токсичны для культур клеток тканей, эти сыворотки можно развести 1/2 перед использованием в тесте. Это эквивалентно 1/4 конечного разведения сыворотки. В данных случаях титры сывороток ниже 1/4 (конечное разведение) считаются отрицательными.

 

ВЕЗИКУЛЯРНАЯ БОЛЕЗНЬ СВИНЕЙ (SVD)

 

Тесты на везикулярную болезнь свиней проводятся в соответствии с Решением 2000/428/ЕС <*>.

———————————

<*> ОЖ N L 167, 7.7.2000, стр. 22.

 

КЛАССИЧЕСКАЯ ЧУМА СВИНЕЙ (CSF)

 

Тесты на классическую чуму свиней проводятся в соответствии с Решением 2002/106/ЕС <*>.

———————————

<*> ОЖ N L 39, 9.2.2002, стр. 71.

При проведении тестов на классическую чуму свиней необходимо следовать руководствам, указанным в соответствующей главе «Руководства МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных».

Оценка чувствительности и специфичности серологического теста на классическую чуму свиней должна проводиться в официальной лаборатории, имеющей действующую систему контроля качества. Должно быть продемонстрировано, что используемые тесты распознают ряд слабых и сильных положительных сывороток и позволяют выявлять антитела на ранней стадии и в период выздоровления.

 

ВЕЗИКУЛЯРНЫЙ СТОМАТИТ (VS)

 

Тест на вирус-нейтрализацию (ВН) должен проводиться согласно протоколам тестирования по везикулярному стоматиту, установленным в Главе 2.1.19 «Руководства МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных».

Следует считать, что сыворотки, которые предотвращают цитопатогенное действие (ЦПД), при разведениях 1/32 и выше, содержат антитела к вирусу везикулярного стоматита.

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован.

*

code